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人参皂苷Rh2对白血病的影响

发布时间:21-07-30

观察人参皂苷Rh2对人白血病细胞株HL60增殖和凋亡的调节作用。

方法:利用流动细胞术检测白血病细胞株HL60在人参皂苷Rh2处理过程中细胞增殖周期的变化和;另一方面,通过动物实验,将裸鼠注射到药物处理前后的细胞株中,验证该药物能否有效抑制动物体内HL60细胞的恶性增殖和白血病症状。

结果:药物处理后HL60细胞在G1期的比例下降,S期的比例显着上升(P<0.05),药物处理后HL60细胞的初期和中晚期的细胞死亡率为40%左右,明显高于未处理组HL60细胞,人参皂苷Rh2通过介导S期的阻滞作用使HL60细胞进入死亡程序。

通过动物实验证明,人参皂苷Rh2可以抑制HL60细胞在体内的恶性增殖。结论:人参皂苷Rh2可以抑制人类白血病细胞HL60的恶性增殖,促进其死亡。人参是中医的传统补气药物,因其攻补兼施、毒副作用小或无、注重整体优势而得到广泛认可。

人参皂苷单体Rh2是从红参中提取的天然活性成分,具有较高的抗肿瘤活性。研究人参皂苷单体Rh2对HL60细胞增殖和凋亡的影响,为进一步阐明人参皂苷单体抗白血病机制,为白血病的临床治疗提供更多的实验依据。材料和方法1。材料1.1细胞培养HL60细胞为第二军医大学医学发育生物学中心馈赠,用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的RPMI1640(Gibco)在37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞培养板、培养瓶、培养皿(FALCON、BD)。

1.2人参皂苷Rh2配液人参皂苷Rh2(采购上海同田生物技术有限公司)溶于PBS(pH值7.4),配制50g/L母液,超滤除菌,-20℃保存备用。使用RPMI1640配制所需工作浓度50mg/L,4℃保存备用。1.3动物BALB/cNu品系裸鼠共24只,3-5周龄,雌雄各半,体质约15-25g,采购上海斯莱克实验动物有限公司,合格证批号为SXCK(沪)2007-005。

2.方法2.1观察人参皂苷单体Rh2对细胞生长的抑制作用,取对数生长期细胞制成细胞悬液,浓度1×104/mL,接种于24孔培养板,每孔1mL。6小时后,加入不同浓度的人参皂苷单体Rh2,使最终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00毫克/升,每个质量浓度组设置4个孔。12、24、36、48、60、72小时,每次取3个孔细胞,轻轻吹均匀,血细胞计数板(密理博细胞计数器)计数,每孔3次,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=[1-(处理组细胞绝对数/对数)×100%。

2.2细胞凋亡检测分别收集未处理组HL60细胞和药物处理组HL60细胞,每组约2×105个细胞,离心清除,加入100μLPBS。室温避光孵化30分钟后,2分钟PBS洗涤2次,加入400μLPBS,在机器检测前5分钟加入5μLPI(50μg/μL)。流式细胞计LSRⅱ(BDBiosciences)计数10000个细胞,检测细胞凋亡。

2.3细胞周期测定未处理组HL60细胞和工作浓度药物处理3天后HL60细胞,每组约1×106个细胞,至离心管后加入70%乙醇,混合均匀,4℃固定24小时。用PBS洗净固定的细胞2次,加入100μLPBS,混合均匀。加入50μLRNA酶(1mg/mL)37℃消化30分钟,每根管子加入400μLPBS,将细胞液转入相应的流式管,上机前5min每根管子加入50μLPI(250μg/μL),混合均匀。流式细胞计数1000个细胞,检测细胞周期分布;分析软件采用ModfitLT3.0。

2.4体裸鼠动物实验BALB/cNu品系裸鼠共24只,随机分为3组。采集经过药物处理的HL60细胞和野生组HL60细胞,每组取2×105细胞,离心去清,加入200μLPBS,取1mL注射器抽取细胞悬液,注入裸鼠腹部皮下。SPF级喂养,每日观察。每组裸鼠在注射细胞后1个月内脱臼活杀颈椎,观察组织和器官的颜色、光泽、纹理、结节等。分别取肺、肝、肾、脾等组织器官,福尔马林固定后HE染色进行病理检查。

2.5统计方法采用SPSS17.0软件进行数据分析,整体采用方差分析,P<0.05表示差异具有统计意义。

结果1。人参皂苷Rh2对HL60细胞生长的抑制作用。人参皂苷Rh2可以明显抑制HL60细胞的增殖,具有剂量和时间依赖性。最佳药物浓度为50μg/mL,时间为72h,对细胞增殖的影响变化最明显。药物处理组细胞的生长抑制率为42.5%。2.人参皂苷Rh2对HL60细胞周期的影响工作浓度药物处理细胞3天后进行流动细胞周期检测。图1显示,对照组G1细胞占72.85%,S细胞占20.76%,G2细胞占6.39%。G1细胞占38.32%,S细胞占55.97%,G2细胞占5.71%。

二组试验数据方差分析结果为:P=0.000<0.05,提示人参皂苷Rh2能介导HL60细胞在S期发生阻滞作用。三、AnnexinV-FITC/PI双染色法流式细胞检测细胞凋亡:从图2中显示:左下象限为活细胞,即FITC-/PI-;右上象限为坏死细胞和凋亡晚期细胞,即FITC+/PI+;右下象限为早期凋亡细胞,即FITC+/PI-;通过分析计算,可获得各类细胞的比例。流式结果表明,药物处理后坏死细胞和凋亡晚期细胞占总细胞的40.80%,早期凋亡细胞占总细胞的41.99%,未处理组HL60细胞占总细胞的60%,早期凋亡细胞占总细胞的7.45%,早期凋亡细胞占总细胞的40.80%,早期凋亡细胞占总细胞的41.99%,而未处理组HL60细胞占总细胞的60%。

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